Hochdurchsatz-Sequenzierung:

• Internationales Forschungsprojekt (1990–2003) sequenzierte menschliches Genom
• Anfängliche Kosten: 3 Mrd. US-Dollar
• Entwicklung schnellerer, kostengünstigerer Methoden seit 2006
• 2006: Mehrere Monate für Sequenzierung, heute weniger als ein Tag

Synthetische Oligonukleide und Fluoreszenz-Markierung:

• Verwendung synthetischer Oligonukleide
• Fluoreszenz-Markierung dokumentiert durch Spezialkamera

DNA-Sequenzierung:

• Weiterentwicklung von Sanger-Methode zu Next Generation Sequencing (Hochdurchsatz-Sequenzierung)
• Prinzip basiert auf paralleler Sequenzierung vieler kurzer DNA-Fragmente
• Bioinformatik für Analyse und Verarbeitung der biologischen Daten

Präparierung der DNA-Fragmente:

• DNA wird mit Enzymen auf ca. 100 bp kürzere Fragmente aufgeteilt
• Doppelstrang wird aufgespalten, Einzelstränge dienen als Vorlage für komplementäre DNA-Synthese
• Verknüpfung mit synthetischen Oligonukleiden, Aufbringung auf festen Träger und Vervielfältigung mittels PCR

Vorgehensweise der Sequenzierung:

• Erhitzung der DNA-Fragmente, Zugabe von DNA-Polymerase, dNTPs und komplementärem Primer
• Markierung der dNTPs mit Fluoreszenzfarbstoffen
• Sequenzierung in etwa 100 Zyklen, Spezialkamera erfasst eingebaute Nucleotide
• Ermittlung der DNA-Sequenz aus Bildabfolge

Sequenzierung durch Hybridisierung:

• Geeignet für Überprüfung spezifischer DNA-Sequenzen
• DNA-Probe wird aufbereitet, in Fragmente zerlegt und mittels PCR vervielfältigt
• Markierte Fragmente auf Genchip aufgebracht, Hybridisierung mit komplementären Sequenzen
• Laser-Scan und Computeranalyse für Genexpressionsmuster und Mutationen

Anwendung in der Hautkrebsfrüherkennung:

• Hybridisierung ermöglicht Unterscheidung von Hautkrebszellen in frühen Stadien
• Fluoreszenz-Punktmuster zeigt spezifisches Genexpressionsmuster
• Laser-Scan und Computeranalyse helfen bei der Identifikation von Hautkrebszellen
  ![[Natura 8.4 - Hochdurchsatz-Sequenzierung.pdf]]