Durch verschiedene Ansätze von DNA-Sequenzierung kann die Basensequenz eine DNA-Abschnitts ermittelt werden. Das Grundprinzip der Sequenzierung beruht auf der Kettenabbruchmethode. Genmutationen können auf diese Weise nachgewiesen werden
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| T | T | T | T | ||||||||||||||
| G | G | G | |||||||||||||||
| A | A | A | A | G | |||||||||||||
| C | C | C | |||||||||||||||
Sequenzierung der DNA
Kettenabbruchverfahren
- Basenabfolge eines DNA-Strangs soll ermittelt werden
- Denaturierung durch Erhitzen
- 2 DNA-Doppelstränge werde in vier Einzelstränge geteilt
- man gibt 4 Primer mit bekannter Basensequenz dazu
- Beim abkühlen binden die 4 Primer komplementär an die zu sequenzierenden DNA-Einzelstränge
- DNA-Polymerase verlängert Primer (wie bei Replikation)
- Kettenabbruchverfahren
- Es werden modifizierte Nukleotide verwendet, die die DNA-Kette nach dem Einbau nicht weiter verlängern.
- Einzelsträngige DNA wird mit diesen Nukleotiden synthetisiert.
- Wenn ein modifiziertes Nukleotid eingebaut wird, stoppt die Synthese.
- Die abgebrochenen DNA-Fragmente werden getrennt und sequenziert, um die ursprüngliche Sequenz zu bestimmen.
- Es entstehen unterschiedlich lange Sequenzierungsansätze
- Trennung der Sequenzierungsansätze kann mit Gel-Elekrophorese erfolgen
- DNA-Abschnitte werden nach länge getrennt
Gel-Elektrophorese
- DNA-Sequenzen werden in dreidimensionalen Netz aus Gel(Agarose) getrennt
- DNA-Sequenzen werden in Vertiefungen im Gel pipettiert
- Gel befindet sich in Salzlösung
- mittels Elektroden wird elektrisches Feld angelegt, in dem die DNA-Fragmente zu positiven Pol wandern
- DNA-Fragmente sind negativ wegen Phosphat-gruppe
- Je nach länge der DNA-Fragmente wandern sie unterschiedlich schnell zum Plus-Pol
- kleinere DNA-Fragmente bewegen sich schneller als lange
- gleichlange DNA-Fragmente ordnen sich im selben Bereich an
- werden als Banden bezeichnet
- können mit Farbstoff markiert werden
- Um die Länge zu ermitteln kann man ein DNA-Fragment mit bekannter länge mitlaufen lassen
- Zur weitern Untersuchung kann man die DNA-Fragmente mittels PCR vervielfältigen
Ablesen der komplementären Sequenz
- Um die Länge zu ermitteln kann man ein DNA-Fragment mit bekannter länge mitlaufen lassen und vergleichen
Moderne Ansätze der DNA-Sequenzierung
- man kann die Didosoxynucleotide farblich markieren
- Da man weiß, für welches Nukleotid das markierte Didosoxynucleotid bindet, kann man die Abfolge ablesen
![[Natura 8.4 - Sequenzierung der DNA.pdf]]